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分子診斷是指通過(guò)分子生物學(xué)的檢測(cè)手段，檢測(cè)患者體內(nèi)基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的技術(shù)。由于其檢測(cè)速度快、靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于血液篩查、 遺傳性疾病、傳染性疾病、腫瘤伴隨診斷等領(lǐng)域。比如現(xiàn)今與我們息息相關(guān)的新冠核酸檢測(cè)，就屬于分子檢測(cè)的應(yīng)用實(shí)例。分子診斷的檢測(cè)往往需要標(biāo)準(zhǔn)品，作為對(duì)照，校正系統(tǒng)誤差，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。下面景源實(shí)驗(yàn)就和大家分享分子診斷的背景知識(shí)和標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用意義吧！

應(yīng)用于分子診斷中的檢測(cè)技術(shù)

分子診斷主要檢測(cè)基因的序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平，主要的檢測(cè)技術(shù)包括PCR、高通量測(cè)序、熒光原位雜交（FISH）、基因芯片等。其中，PCR與高通量測(cè)序等應(yīng)用最為廣泛。

PCR技術(shù)的原理是以樣品DNA為模板，在聚合酶、引物和dNTP等擴(kuò)增體系下復(fù)制出大量的子代DNA。第一代PCR通常在擴(kuò)增后，采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，一般需要結(jié)合一代測(cè)序才能對(duì)基因型做定性分析。第二代熒光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，在反應(yīng)體系中加入熒光物用于指示反應(yīng)進(jìn)程，利用熒光信號(hào)的變化來(lái)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，通過(guò)熒光曲線來(lái)判斷結(jié)果，并可以借助Cq值和標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量。第三代PCR 微滴式數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）也用于定量分析，相比于二代PCR靈敏度更高，能測(cè)定基因拷貝數(shù)。其原理是將反應(yīng)體系分為成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，再通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)，并根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例計(jì)算出模板數(shù)量。

二代測(cè)序由于通量高，在檢測(cè)多個(gè)樣品和多個(gè)位點(diǎn)時(shí)，能節(jié)省時(shí)間、降低成本，所以在分子診斷中有巨大的應(yīng)用潛力。其原理是通過(guò)模板DNA 分子的化學(xué)修飾，將其錨定在納米孔或微載體芯片上，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，在 DNA 聚合酶鏈反應(yīng)或 DNA 連接酶反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)采集熒光標(biāo)記信號(hào)或化學(xué)反應(yīng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)堿基序列的解讀，一次性可完成幾十萬(wàn)至上百萬(wàn)條序列的測(cè)定。

分子診斷的應(yīng)用領(lǐng)域

分子診斷的應(yīng)用場(chǎng)景很多，如今主要應(yīng)用的領(lǐng)域有無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）、伴隨診斷、腫瘤早篩和傳染病檢測(cè)等。

NIPT是通過(guò)高通量測(cè)序等手段，檢測(cè)母體內(nèi)的胎兒遺傳信息，判別胎兒是否患染色體異常疾病，包括21 三體綜合征（唐氏綜合征）、18 三體綜合征（愛(ài)德華氏綜合征）、13 三體綜合征 （帕陶綜合征）。NIPT具有檢測(cè)準(zhǔn)確率高、周期短、漏診率低和對(duì)母體損害低等優(yōu)點(diǎn)。

伴隨診斷是分子診斷的另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域。在使用分子靶向藥前，需要先檢測(cè)患者是否存在藥物靶點(diǎn)，提高用藥的準(zhǔn)確性。常用的檢測(cè)方法有PCR、NGS、FISH和免疫組化（IHC）等，其中PCR測(cè)序是常用的檢測(cè)手段，具有快捷準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

在腫瘤早篩中也會(huì)應(yīng)用到分子診斷技術(shù)。腫瘤形成的其中一個(gè)重要原因是基因突變。因此盡早篩查出這類人群，開(kāi)展預(yù)防和治療是很重要的?，F(xiàn)階段多通過(guò)內(nèi)鏡、組織活檢等手段檢測(cè)，但操作麻煩、準(zhǔn)確性不高且存在漏篩。而基于 PCR、NGS 等分子診斷技術(shù)的液體活檢則具有很大的應(yīng)用潛力，其原理是通過(guò)檢測(cè)從轉(zhuǎn)移灶釋放到血液中的腫瘤細(xì)胞或者DNA。具有取樣方便、靈敏度高、非侵入性、有效應(yīng)對(duì)腫瘤異質(zhì)性、在疾病發(fā)展的不同階段可重復(fù)取樣等優(yōu)勢(shì)。

分子診斷在傳染病篩查的應(yīng)用主要體現(xiàn)在新冠檢測(cè)和血液篩查。在新冠篩查中，主要應(yīng)用qPCR檢測(cè)，能快速準(zhǔn)確地篩查出感染者，是減少新冠傳播的有力手段，具有精準(zhǔn)度高和辨識(shí)度強(qiáng)等特點(diǎn)。血液篩查是為了確保血液制品的質(zhì)量、避免交叉污染和保護(hù)工作人員的安全，防止相關(guān)疾病的感染者進(jìn)入供血隊(duì)伍。這些疾病包括：人類免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒 （HCV）、梅毒螺旋體、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）等。早期以酶免檢測(cè)（ELISA 技術(shù)）為主，但是靈敏度低。而以 PCR 技術(shù)為主的核酸檢測(cè)（NAT）具有更高的靈敏性和特異性，能顯著降低輸血感染病毒帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。

標(biāo)準(zhǔn)品在分子診斷中的應(yīng)用

分子診斷的流程具有多個(gè)環(huán)節(jié)，從樣品樣本提取到變異檢測(cè)，每個(gè)環(huán)節(jié)都存在不確定因素和不可規(guī)避的系統(tǒng)誤差，這使得分析結(jié)果存在假陽(yáng)性或假陰性的可能。因此需要標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)檢測(cè)與校對(duì)分析體系的準(zhǔn)確性。

分子診斷標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該具備以下3個(gè)特征:

1.  代表性。標(biāo)準(zhǔn)品需要與待測(cè)樣品在基因遺傳背景、細(xì)胞類型、組織類型和處理方式等方面高度相似，才能模擬待測(cè)樣品的檢測(cè)過(guò)程，以分析實(shí)驗(yàn)體系的精準(zhǔn)度和判別待測(cè)樣品結(jié)果。

2. 可量化。標(biāo)準(zhǔn)品需要具備突變頻率階梯性，將編輯細(xì)胞與野生型細(xì)胞以不同比例混合，用于模擬不同疾病或檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)上下限。

3. 持續(xù)穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)品需要能持續(xù)且穩(wěn)定生產(chǎn)。

在PCR檢測(cè)變異的流程中，可以用標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)驗(yàn)證試劑盒的提取效率、變異檢測(cè)的準(zhǔn)確度、試劑盒的靈敏度等。在核酸提取步驟中，樣本經(jīng)過(guò)不同的處理往往對(duì)核酸提取率有影響，比如經(jīng)過(guò)福爾馬林、石蠟包埋等處理等。如果存在與患者樣本處理方式、材質(zhì)、細(xì)胞復(fù)雜性和結(jié)構(gòu)特性相似的標(biāo)準(zhǔn)品，例如FFPE標(biāo)準(zhǔn)品，則可以在提取環(huán)節(jié)中得知提取效率。如果更換提取體系時(shí)，只要使用相同的標(biāo)準(zhǔn)品，還可以比較不同提取體系的提取效率。同理，標(biāo)準(zhǔn)品在文庫(kù)構(gòu)建階段和測(cè)序階段也發(fā)揮著相同的作用，用于確定建庫(kù)效率和測(cè)序質(zhì)量。

生信分析位點(diǎn)變異情況時(shí)，由于標(biāo)準(zhǔn)品的突變位點(diǎn)、突變基因型和突變頻率等信息都是通過(guò)人為修飾且已知，所以如果信息分析流程得出的變異檢測(cè)結(jié)果與此不符，就需要調(diào)整參數(shù)，以得到準(zhǔn)確的分析體系，同時(shí)還能準(zhǔn)確判斷患者樣品的實(shí)際變異情況。

點(diǎn)突變細(xì)胞在分子診斷中的應(yīng)用

基因點(diǎn)突變通常指單個(gè)堿基的替換或插入缺失。隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，不管是基于同源重組（HDR）或單堿基編輯系統(tǒng)的基因點(diǎn)突變修飾變得更加容易實(shí)現(xiàn)。全球有超過(guò)50000種人遺傳疾病，其中大部分是由基因組的點(diǎn)突變引起的。例如罕見(jiàn)病，點(diǎn)突變引起的占了50%。對(duì)于這些疾病的分子診斷就顯得更為重要。同樣的，這些基因點(diǎn)突變疾病的分子診斷也會(huì)面臨上述的問(wèn)題：需確保分析體系的準(zhǔn)確性。此時(shí)以點(diǎn)突變細(xì)胞作為分子檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，便可以解決。

小結(jié)
隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的概念不斷深入人心，分子診斷越來(lái)越貼切我們的生活，同時(shí)由于技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR、高通量測(cè)序等技術(shù)的靈敏度、精確性和成本都不斷再改善，促使分子診斷行業(yè)快速發(fā)展。但由于檢測(cè)系統(tǒng)存在不可消除的系統(tǒng)誤差或不確定因素，檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。那么設(shè)置分子診斷標(biāo)準(zhǔn)品，消除系統(tǒng)誤差則顯得十分重要。